Метод выделения ДНК из индивидуальных клеток ДВ для использования в ПЦР
Под бинокулярной лупой из капли пробы фитопланктона с помощью стеклянной микропипетки (диаметром 30-50 мкм), оттянутой из стеклянного капилляра, отбирали отдельные клетки, отмывали проводкой через 2-3 капли дистиллированной воды и компактно помещали на силиконизированное покровное стекло, размещенное на предметном столике инвертированного микроскопа Axiovert 10 Zeiss), совмещенного с микроманипулятором. После испарения влаги, панцири перфорировали оттянутой стеклянной иглой (диаметром 3 мкм), управляемой микроманипулятором. Затем на поврежденные клетки наносили 1-2 мкл раствора с протеиназой К (0,5 мг/мл в буфере, содержащем 0,1% SDS или 0,1% Triton Х-100; 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 10 тМ NaCl; 0,5 мМ ЭДТА), в которую освобождалось содержимое клеток через поврежденные мембраны и отверстия в кремниевой створке. Каплю покрывали жидким парафином, покровное стекло с материалом переносили в чашку Петри и помещали в инкубатор на 2 час при 60°С. Затем каплю разводили 250 нл 0,1% Triton Х-100 и 3 мкл полученного раствора переносили в пробирки, содержащие 15 мкл ПЦР-буфера. Оставшиеся на покровном стекле панцири высушивали на воздухе, остаток жидкого парафина удаляли трехкратным промыванием гексаном (нанося каплю сверху). После испарения гексана препарат на покровном стекле обрабатывали в течение 2 час при 75°С 30% перекисью водорода, отмывали дистиллированной водой, высушивали на воздухе, напыляли золотом в вакуумной установке Balzers SCD 004 и исследовали в СЭМ Philips 525M. По рисунку 3 видно, что по оставшимся фрагментам панцирей можно идентифицировать вид, потому как основные морфологические признаки створок можно наблюдать: и лицевая часть створок, и загиб сохраняются, можно определить их размеры и плотность расположения ареол, также сохраняются шипы.